Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒
Blue/Clear Native PAGE Electrophoresis Kit
|
貨號
|
名稱
|
包裝
|
|
RTD6139-0312
|
Blue/Clear非變性凝膠電泳試劑盒(U型板3-12%預制膠，通用型)
|
10 次
|
|
RTD6139-0416
|
Blue/Clear非變性凝膠電泳試劑盒(U型板4-16%預制膠，通用型)
|
10 次
|
● 貨品內容：
|
組份
|
貨號
|
名稱
|
規(guī)格
|
保存
|
|
1
|
RTD6138-0312
|
3-12% RealPAGE Native BN/CN 預制膠
|
10板
|
4℃
|
|
RTD6138-0416
|
4-16% RealPAGE Native BN/CN 預制膠
|
10板
|
4℃
|
|
2
|
BC500P
|
10×BN/CN PAGE電泳緩沖液（干粉）
|
500 ml
|
RT
|
|
3
|
PL114
|
4×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩沖液
|
1 ml
|
-20℃
|
|
4
|
BC270
|
2% G-250染料（電泳用）
|
20 ml
|
RT
|
|
5
|
BC260
|
5% G-250染料（上樣用）
|
1 ml
|
4℃
|
|
6
|
|
說明書
|
一份
|
|
● 產品簡介：
Blue/Clear Native PAGE（BN/CN-PAGE）是一種從生物樣品（質膜，胞漿等）中非變性分離蛋白質復合物的電泳技術。其原理是用溫和去污劑(如 DDM，digitonin)將蛋白復合體從細胞膜中以近似天然的狀態(tài)分離出來，Blue Native PAGE （BN-PAGE）是用考馬斯亮藍 G-250 代替 SDS與蛋白結合而使其帶負電荷，根據(jù)蛋白分子量不同在 PAGE膠中得到分離；Clear Native PAGE（CN-PAGE）是電泳緩沖液中不加入任何染料，電泳中始終保持蛋白的天然電荷和活性狀態(tài)，然而，其蛋白的分辨率要低于Blue Native PAGE。另外，BN-PAGE由于考馬斯亮藍G-250存在，使蛋白都覆蓋上負電荷，可以分離堿性蛋白（pI＞7）；而CN-PAGE只適合于酸性蛋白（pI＜7）的分離。
本產品包括BN/CN-PAGE制膠的所有成分，方便使用。可以用于分離分子量在 60 kD-1000 kD 的蛋白復合體，樣品可以來于胞漿、細胞總裂解液、細胞膜、線粒體膜和葉綠體膜等。電泳后可直接用于考染、銀染、Western 雜交、SDS-PAGE電泳、蛋白純化、蛋白活性檢測等分析實驗，也可直接用于電洗脫制備蛋白。
● 運輸和貯存：
本產品常溫運輸；組份按照標簽溫度貯存；有效期一年。
● 使用說明：
1. 樣品制備：
該試劑盒不含樣品制備的相關試劑，根據(jù)樣品種類選擇不同提取方法。植物類囊體BN樣品制備可以選擇植物類囊體膜提取試劑盒（貨號:RTU5002）；動物總蛋白BN樣品制備可以選擇動物胞漿活性蛋白提取試劑盒(貨號:RTD8106)；動物膜蛋白BN樣品制備可以選擇動物膜蛋白提取試劑盒（貨號:RTD8111,RTD8112）；動物線粒體BN樣品制備可以選擇動物線粒體提取試劑盒（貨號:RTD8115和RTD8116)。
2. 電泳：
2.1 拆開預制膠包裝，將預制膠安裝在合適的電泳槽中。
注：伯樂Mini III或Mini-PROTEAN Tetra Cell，天能VE-180，六一24K系列電泳槽請確保密封條的安裝方向（下圖）。
六一其他系列，君意東方JY-SCZ2/4，百晶BG-verMINI等電泳槽可以直接使用預制膠。
不兼容Thermol系列電泳槽。
2.2 準備電泳緩沖液：
將10×BN/CN PAGE電泳緩沖液（干粉）溶于500 ml滅菌水中，徹底溶解，測定pH應為7.0左右，不要調節(jié)pH。用前稀釋10倍即配成1×BN/CN PAGE電泳緩沖液。
2.2.1 CN-PAGE電泳：
陽極緩沖液和陰極緩沖液均直接使用1×BN/CN PAGE電泳緩沖液進行電泳。
2.2.2 BN-PAGE電泳：
陽極緩沖液使用1×BN/CN PAGE電泳緩沖液，陰極緩沖液按照下表配制：
|
|
1×藍色陰極緩沖液
|
|
|
150 ml
|
|
10×BN/CN PAGE電泳緩沖液
|
15 ml
|
|
2% G-250 染料（電泳用）
|
1.5 ml
|
|
超純水
|
定容至150 ml
|
2.3準備樣品：
2.3.1 CN-PAGE電泳：
|
總體積
|
10 μl
|
|
蛋白樣品
|
x μl
|
|
4×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩沖液
|
2.5 μl
|
|
超純水
|
補至10 μl
|
|
|
不要加熱
|
2.3.2 BN-PAGE電泳：
2.3.2.1 植物類囊體膜蛋白電泳：
|
總體積
|
10 μl
|
|
|
含去垢劑樣品*
|
|
植物類囊體膜蛋白樣品
（2%DDM增溶）
|
x μl
|
|
4×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩沖液
|
2.5 μl
|
|
5% G-250染料（蛋白上樣）
|
1 μl
|
|
超純水
|
補至10 μl
|
|
|
不要加熱
|
*植物類囊體膜蛋白電泳中，含去垢劑樣品中染料加入按照以下原則：
植物類囊體樣品中G250終濃度為去垢劑終濃度的1/4。例如樣品中DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside，β-DM， n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷）終濃度為2%，則需要G-250終濃度為0.5%。10 μl蛋白樣品中需要加5% G-250染料1 μl。
2.3.2.2 動物線粒體BN樣品電泳：
|
總體積
|
10 μl
|
|
|
含去垢劑樣品*
|
|
動物線粒體BN樣品
（1%DDM增溶）
|
x μl
|
|
4×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩沖液
|
2.5 μl
|
|
5% G-250染料（蛋白上樣）
|
0.25 μl
|
|
超純水
|
補至10 μl
|
|
|
不要加熱
|
*動物線粒體BN樣品電泳中，含去垢劑樣品中染料加入按照以下原則：
動物線粒體BN樣品中G250終濃度為去垢劑終濃度的1/8。例如樣品中DDM終濃度為1%，則需要G-250終濃度為0.125%。10 μl蛋白樣品中需要加5% G-250染料0.25 μl。
2.4電泳過程；
2.4.1 CN-PAGE電泳：
電泳內外槽均使用1×BN/CN PAGE電泳緩沖液。在電泳槽的內槽內加入1×BN/CN PAGE電泳緩沖液(讓電泳緩沖液漫過加樣孔)，輕輕撥出預制膠梳子，用1ml吸頭沖洗加樣孔3次，隨后在電泳槽外槽加入適量的1×BN/CN PAGE電泳緩沖液。
|
CN-PAGE電泳
|
|
恒電壓
|
起始電流
|
結束電流
|
電泳時間
|
|
120V
|
10-15mA/板膠
|
4-10mA/板膠
|
50+min
|
|
注：冰浴電泳
|
2.4.2 BN-PAGE電泳：
BN-PAGE電泳外槽使用1×BN/CN電泳緩沖液；內槽開始電泳使用的是1×藍色陰極緩沖液，冰浴電泳，等待電泳指示前沿到達凝膠1/3處時，將電泳緩沖液更換為1×BN/CN電泳緩沖液，繼續(xù)后續(xù)電泳，因為過多染料會影響蛋白在凝膠中的遷移以及蛋白后續(xù)的轉膜實驗。
BN-PAGE電泳條件（一板膠）
|
恒電壓
|
起始電流
|
電泳時間
|
緩沖液
|
|
|
120 V
|
8-15 mA
|
20-25 min
|
1×藍色陰極緩沖液
|
冰浴電泳
|
|
指示前沿至凝膠頂部三分之二處，更換內槽緩沖液為1×BN/CN 電泳緩沖液
|
|
恒電壓
|
繼續(xù)電泳時間
|
結束電流
|
緩沖液
|
|
|
120 V
|
45 min +
|
3-5 mA
|
1×BN/CN電泳緩沖液
|
冰浴電泳
|
3. 轉膜：
BN-PAGE轉膜必須用PVDF膜，不能用NC膜，因為NC膜與G-250結合非常緊密，不易去除。轉膜后PVDF膜上的藍色染料可以用無水甲醇漂洗去除。轉膜緩沖液推薦使用10×BN轉膜緩沖液（貨號：BC600P）。
4. 染色：
4.1 將電泳后的PAGE膠取下放入塑料容器中，加入適量FastBlue蛋白染色液或常規(guī)考馬斯亮藍染色液（以剛剛覆蓋過膠面為適），條帶1-2分鐘即可見。
4.2 搖床常溫搖動10-15分鐘至條帶清晰可見。
4.3 加入適量蒸餾水脫色，期間更換1-2次蒸餾水，搖床常溫搖動10-15分鐘至背景干凈。
4.4 觀察保存結果。
5. 實驗示例：
BN-PAGE 3-12% Precast Gel
穩(wěn)壓120V 1.5 h 1×BN/CN電泳緩沖液 冰浴電泳
BN-PAGE 4-16% Precast Gel
恒壓 120V 2 h 1×BN/CN電泳緩沖液 冰浴電泳
K562 膜蛋白BN-WB檢測
樣品：膜蛋白提取樣品用2%DIG和1%DM增溶（ 貨號：RTD8111，動物膜蛋白提取試劑盒(細胞)） ，
胞漿蛋白CY做對照
電泳：3-12% BN預制膠（貨號：RTD6138-0312），穩(wěn)壓200V 1×藍色陰極緩沖液至指示前沿距離膠上沿2/3處，
更換為無色1×BN/CN PAGE電泳緩沖液，電泳時間共83分鐘
膠預處理：膠浸泡于buffer中（12.5mM Tris，2%SDS，20%甘油，50mM DTT pH6.8），微波煮沸20秒，37度15min后轉膜
轉膜：0.45μm PVDF膜，10×BN轉膜緩沖液（貨號：BC600P）稀釋為1×BN轉膜緩沖液加20%甲醇，
恒流200mA 2小時，未冰浴。
轉膜效果檢測：膜用麗春紅染色液染色（貨號：RTD6301）有可見條帶，膠用FastBlue蛋白染色液染色
（貨號：RTD6202）幾乎無條帶，證明轉膜成功。膜用無水甲醇清洗5分鐘去除膜上藍色殘余。
封閉：Western快速封閉液（貨號：WR5020） RT 封閉10 分鐘；
圖1 一抗：兔單抗GAPDH 1:10000 RT 60min；羊抗兔IgG-HRP 1:5000 RT 60min，ECL曝光6秒
圖2 膜使用Western一抗二抗去除液（弱堿，溫和型）（貨號：WS1200）37度15min，快封10分鐘，
一抗：兔Na-K ATPase 1:5000 RT 60min，羊抗兔IgG-HRP 1:5000 RT 60min，ECL曝光1秒
Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒(RTD6139/RTD6138)
使用該產品發(fā)表部分文章列表：
1. [2021 IF=10.15] SlRIP1b
is a global organellar RNA editing factor, required for normal fruit
development in tomato plants
Author: Jinyan Li, Keru
Wang, Yongfang Yang, Yao Lu, Kaicheng Cui, Yajing Ji, Liqun Ma, Ke Cheng, Oren
Ostersetzer-Biran, Feng Li, Guiqin Qu, Benzhong Zhu, Daqi Fu, Yunbo Luo,
Hongliang Zhu
Journal: New
Phytologist 2023，Volume237, Issue4，F(xiàn)ebruary 2023，Pages 1188-1203
Institution： China Agricultural University
Paper link：https://doi.org/10.1111/nph.18594
2.
[2022 IF=8.0] Tektin bundle interacting protein, TEKTIP1,
functions to stabilize the tektin bundle and axoneme in mouse sperm flagella
Author: Xinyan Geng,Huijuan Jin,
Lan Xia.Binbin Wang,Suren Chen
Journal: Cellular and Molecular Life Sciences (2024)
81:118
Institution: Beijing
Normal University
Paper link：https://doi.org/10.1007/s00018-023-05081-3
3.
[2022 IF2.6] What are the main proteins in the hemolymph
of Haemaphysalis flava ticks?
Author: Dan Li , Lei Liu , Zi-ling Liu
, Yuan Tian , Xin Gao，Tian-yin Cheng
Journal: Frontiers in Veterinary Science Published 17
July 2024
Institution: Hunan
Agricultural University
Paper link： https://doi.org/10.3389/fvets.2024.1387719