X-Gal/IPTG即用型溶液
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產品編號
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產品名稱
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包裝
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貯存
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XG0516
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X-Gal
20mg/ml
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5ml
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-20℃
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IP0560
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IPTG
50mg/ml
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5ml
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-20℃
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說明書
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一份
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● 產品簡介：
藍白斑篩選是重組子篩選的一種方法。現在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點（MCS），它并不破壞閱讀框，但可使少數幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。因此，宿主和質粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成具有酶學活性的蛋白質。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質粒之間實現了互補，稱為α-互補。由α-互補而產生的LacZ+細菌在誘導劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時產生藍色菌落，因而易于識別。然而，當外源DNA插入到質粒的多克隆位點后，幾乎不可避免地導致無α-互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質粒的細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍白斑篩選。如用藍白斑篩選則經連接產物轉化的鈣化菌平板37℃倒置培養(yǎng)12-16hr后，含有插入片段重組質粒的細菌形成白色菌落，而沒有插入片段的質粒細菌形成藍色菌落。
● 配制方法：
50mg/ml IPTG 5ml：取250mg IPTG，溶于5ml無菌水中，過濾除菌后-20℃貯存。
20mg/ml
X-Gal 5ml：取100mg X-gal，溶于5ml 二甲基甲酰胺（DMF），棕色瓶中-20℃貯存。此試劑無需滅菌。
● 實驗程序：
1 轉化平板的制備：
向鋪好的含有相應抗生素的固體瓊脂平板表面加入16 μl的IPTG(50 mg/ml)、40 μl的X-gal(20 mg/ml)，使用無菌的彎頭玻璃棒將其均勻的涂開，盡量使溶解X-gal的二甲基甲酰胺揮發(fā)干凈。
2 轉化
i.
取部分連接產物加到50-100 μl感受態(tài)細胞中（感受態(tài)細胞應剛從-70℃冰箱取出放于冰浴上，待剛剛解凍時加入連接產物，連接產物的加入量不超過感受態(tài)細胞體積的十分之一），輕彈混勻，冰浴30分鐘。
ii.
將離心管置于精確42℃水浴90秒，取出管后立即置于冰浴中放置2-3分鐘，其間不要搖動離心管。
iii.
向離心管中加入250-500 μl37℃預熱的SOC或LB(不含抗生素)培養(yǎng)基，150rpm，37℃振蕩培養(yǎng)45分鐘。此步目的是使質粒上相關的抗性標記基因表達，使菌體復蘇。
iv.
將離心管中的菌液混勻，吸取100 μl加到含相應抗生素的SOB或LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細胞均勻涂開。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培養(yǎng)12-16小時。
3
檢測
將得到的白色菌落接種1-5 ml LB培養(yǎng)基，37℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜，保存菌種后提取質粒，應用PCR或酶切方法鑒定插入片段是否正確。
X-gal/IPTG發(fā)表文章列表：
1. [2022
IF=2.7] Functional verification of the JmLFY gene associated with the
flowering of Juglans mandshurica Maxim..
Author: Jiayou Cai, Ruoxue Jia, Ying Jiang, Jingqi Fu, Tianyi Dong,
Jifeng Deng, Lijie Zhang.
Journal: Peer J Published
March 7, 2023
Institution: Shenyang Agricultural University
Paper
link：https://doi.org/10.7717/peerj.14938