單鏈DNA Marker（10-75 nt）非預(yù)混型
|
貨號(hào)
|
名稱
|
規(guī)格
|
|
RTM509
|
單鏈DNA Marker（10-75 nt）非預(yù)混型
|
25次
|
● 產(chǎn)品編號(hào)及規(guī)格：
|
貨號(hào)
|
名稱
|
規(guī)格
|
貯存
|
|
RTM509-01
|
單鏈DNA Marker（10-75 nt）非預(yù)混型
|
62.5 μl
|
-20℃
|
|
DL080-01
|
2×TBE尿素上樣緩沖液
|
1 ml
|
4℃
|
|
DL112-01
|
2×非變性PAGE DNA上樣緩沖液
|
1 ml
|
4℃
|
● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
單鏈DNA Marker由不同長(zhǎng)度的單鏈DNA分子混合而成，9條帶的大小為10，15，20，25，30，35，40，
50，75
nt。該產(chǎn)品不含有上樣緩沖液，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求使用不同的上樣緩沖液，用于尿素變性電泳或非變性電泳。電泳后的PAGE膠可以使用單鏈DNA
PAGE電泳染色試劑盒（Cat：RTS5103），核酸PAGE電泳染色試劑盒（Cat：RTS5102），核酸快速高靈敏度染色試劑盒（Cat：RTS5101）或核酸染料如RealSafe
Red（貨號(hào)：GR002）或RealSafe
All（貨號(hào)：GR004）進(jìn)行染色，均可以得到清晰的條帶分離效果。
產(chǎn)品附帶2×TBE尿素上樣緩沖液和2×非變性PAGE DNA上樣緩沖液，方便待檢樣品的上樣。
配制好的即用型單鏈DNA Marker以每次上樣5 μl計(jì)算，該產(chǎn)品可以使用大約25次。
● 保存條件和運(yùn)輸：
按照標(biāo)簽溫度貯存；有效期2年；濕冰運(yùn)輸。
● 使用方法：
一. 即用型單鏈DNA Marker（10-75
nt）配制方法：
1.1 進(jìn)行尿素變性電泳：
|
即用型單鏈DNA
Marker（10-75 nt）
|
配制體積 20 μl
|
|
DNA
Marker（10-75 nt）非預(yù)混型
|
10 μl
|
|
2×TBE尿素上樣緩沖液
|
10 μl
|
|
|
混勻，70℃處理5分鐘
|
1.2 進(jìn)行非變性電泳：
|
即用型單鏈DNA
Marker（10-75 nt）
|
配制體積 20 μl
|
|
DNA
Marker（10-75 nt）非預(yù)混型
|
10 μl
|
|
2×非變性PAGE DNA上樣緩沖液
|
10 μl
|
|
|
混勻，不用加熱處理
|
二. 凝膠制備：
注：以下使用方法均以8×10cm凝膠 厚1.0mm示例，其他規(guī)格凝膠請(qǐng)適當(dāng)調(diào)整。
2.1 TBE-尿素凝膠制備：
2.1.1 可以選擇DNA尿素PAGE電泳試劑盒（Cat：RTE4102））或按照以下程序制膠：
表一 TBE-尿素PAGE分離膠配方表 (總體積5 ml，適用于厚度1.0 mm小板膠)
|
單鏈DNA長(zhǎng)度
|
最佳凝膠濃度
|
尿素（克）
|
40%PAA
（29:1）
|
10×TBE
|
補(bǔ)水到總體積
|
10%APS
|
TEMED
|
|
200-1000 nt
|
5%
|
2.1克
|
0.625 ml
|
0.5 ml
|
5 ml
|
50 μl
|
5 μl
|
|
50-400 nt
|
8%
|
2.1克
|
1 ml
|
0.5
ml
|
5 ml
|
50 μl
|
5 μl
|
|
30-300 nt
|
10%
|
2.1克
|
1.25 ml
|
0.5
ml
|
5 ml
|
50 μl
|
5 μl
|
|
10-150 nt
|
15%
|
2.1克
|
1.875 ml
|
0.5
ml
|
5 ml
|
50 μl
|
5 μl
|
|
5-120 nt
|
20%
|
2.1克
|
2.5 ml
|
0.5
ml
|
5 ml
|
50 μl
|
5 μl
|
2.1.2在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液（對(duì)于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可），然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-5 cm的水層，使凝膠表面保持平整。
2.1.3靜置10-20分鐘，待分離膠和水層之間出現(xiàn)一個(gè)清晰的界面后，說明凝膠已聚合。
注：凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)?？梢愿鶕?jù)環(huán)境溫度的不同調(diào)節(jié)APS的加入量。
2.1.4去除覆蓋在分離膠上的水層；按照表二將不同體積成分在一個(gè)小燒杯中混合；最后加入10%過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。
表二 TBE-尿素PAGE 4%濃縮配方表 (總體積2 ml，適用于1.0mm厚度膠)
|
|
各組份體積（ml）
|
|
凝膠濃度
|
尿素
|
40%PAA（29:1）
|
10×TBE
|
滅菌水
|
10%APS
|
TEMED
|
|
4%
|
0.84克
|
0.2 ml
|
0.2 ml
|
補(bǔ)水至體積2 ml
|
20 μl
|
2 μl
|
2.1.5將濃縮膠溶液加至分離膠的上面，直至凝膠溶液到達(dá)前玻璃板的頂端；將梳子插入凝膠內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡。
2.1.6靜置30-60分鐘，等待濃縮膠聚合。
注：凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)?？梢愿鶕?jù)環(huán)境溫度的不同調(diào)節(jié)APS的加入量。
2.2非變性凝膠制備：
2.2.1可以選擇DNA非變性PAGE電泳試劑盒（貨號(hào)：RTE4101）或按照以下程序制膠。
2.2.2按照表三將不同體積的成分在小燒杯或試管中混合；最后加入10%APS和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。
2.2.3在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液（對(duì)于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可），然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-5
cm的水層，使凝膠表面保持平整。
2.2.4靜置10-20分鐘，待分離膠和水層之間出現(xiàn)一個(gè)清晰的界面后，說明凝膠已聚合
表三 TBE-非變性PAGE分離膠配方表 (總體積5 ml，適用于厚度1.0 mm小板膠)
|
|
|
各組份體積（ml）
|
|
最佳DNA分離范圍
|
凝膠濃度
|
滅菌水
|
30%PAA（29：1）
|
5×TBE
|
10%APS
|
TEMED
|
|
70-450 bp
|
6%
|
3
|
1.0
|
1.0
|
0.05
|
0.005
|
|
60-460 bp
|
8%
|
2.66
|
1.34
|
1.0
|
0.05
|
0.005
|
|
50-300 bp
|
10%
|
2.33
|
1.67
|
1.0
|
0.05
|
0.005
|
|
40-200 bp
|
12%
|
2
|
2.0
|
1.0
|
0.05
|
0.005
|
|
25-150 bp
|
15%
|
1.5
|
2.5
|
1.0
|
0.05
|
0.005
|
|
5-100 bp
|
20%
|
0.66
|
3.34
|
1.0
|
0.05
|
0.005
|
注：凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)?？梢愿鶕?jù)環(huán)境溫度的不同調(diào)節(jié)APS的加入量。
2.2.5去除覆蓋在分離膠上的水層；按照表四將不同體積成分在一個(gè)小燒杯或試管中混合；最后加入10%過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。
表四 TBE-非變性PAGE 4%濃縮配方表 (總體積1.5 ml，適用于1.0mm厚度膠)
|
|
各組份體積（ml）
|
|
凝膠濃度
|
滅菌水
|
30%PAA（29：1）
|
5×TBE
|
10%APS
|
TEMED
|
|
4%
|
1.0
|
0.2
|
0.3
|
0.02
|
0.002
|
2.2.6將濃縮膠溶液加至分離膠的上面，直至凝膠溶液到達(dá)前玻璃板的頂端；將梳子插入凝膠內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡。
2.2.7靜置30-60分鐘，等待濃縮膠聚合。
注：凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)?？梢愿鶕?jù)環(huán)境溫度的不同調(diào)節(jié)APS的加入量。
三. 樣品制備：
3.1
根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，配制即用型單鏈DNA
Marker樣品（步驟一）。單鏈DNA樣品使用尿素變性電泳，雙鏈DNA樣品使用非變性電泳，單鏈/雙鏈混合樣品使用非變性電泳。
四. 電泳：
4.1. 預(yù)電泳（可選）：電泳槽內(nèi)外加入適量1×TBE緩沖液穩(wěn)壓200V預(yù)電泳30分鐘。電泳結(jié)束后，用1×TBE緩沖液徹底沖洗加樣孔2-3次。
4.2.上樣：根據(jù)梳齒確定Marker上樣量， 一般是10齒1mm厚梳子上樣5
μl，15齒1mm厚梳子上樣3
μl。
4.3. 連接電源線，打開電源開關(guān)，按照以下條件電泳。
|
|
恒電壓
|
起始電流
|
結(jié)束電流
|
電泳時(shí)間
|
適用條件
|
|
推薦電壓
|
200 V
|
15-20 mA/板膠
|
10-15 mA/板膠
|
60+ min
|
最佳電壓，最優(yōu)的分辨率
|
4.4. 等待上樣緩沖液的溴酚藍(lán)指示前沿到凝膠底部時(shí)終止電泳，取出凝膠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
|
膠濃度
|
溴酚藍(lán)
|
二甲苯菁
|
|
5%
|
~35 nt
|
~130 nt
|
|
8%
|
~19 nt
|
~75 nt
|
|
10%
|
~15 nt
|
~55 nt
|
|
15%
|
~10 nt
|
~52 nt
|
|
20%
|
~8 nt
|
~35 nt
|
五．染色：
用單鏈DNA PAGE電泳染色試劑盒（Cat：RTS5103），核酸PAGE電泳染色試劑盒（Cat：RTS5102）或核酸快速高靈敏度染色試劑盒（Cat：RTS5101）染色均可以得到清晰的條帶分離效果。注：如果使用核酸染料染色，RealSafe Red（貨號(hào)：GR002）或RealSafe All（貨號(hào)：GR004）核酸染料結(jié)合單鏈核酸效果最佳，強(qiáng)烈建議使用以便獲得最佳效果的膠圖。其余染料如GelRed，Goldview，EB等染色效果不好。
六. 電泳示例：
6.1 使用RealSafe Red核酸染料（貨號(hào)：GR002）染色：
15%尿素變性膠分離單鏈DNA
lane 1-9 為10，15，20，25，30，35，40，50，75 nt ssDNA 上樣量為0.5 μg
lane 10：RTM501，單鏈DNA Marker（20-75 nt）預(yù)混型，上樣量5 μl
lane 11：RTM507，單鏈DNA Marker（20-75 nt）非預(yù)混型，配制后上樣量5 μl
lane 12：RTM509，單鏈DNA Marker（10-75 nt）預(yù)混型，配制后上樣量5 μl
電泳條件：1×TBE，恒壓200
V 50 min
染色：RealSafe
Red后染20min，紫外激發(fā)
使用RTM501 單鏈DNA
Marker（20-75 nt）發(fā)表部分文章列表：
1. [2021 IF=3.532] Real-time detection of
SARS-CoV-2 in clinical samples via ultrafast ligation-dependent RNA transcription
amplification
Marker :RTM501，單鏈DNA Marker（20-75
nt）
Author: Peng
Zhang, Yang Li, Dongmei Zhang, Xinghao Zhu, Jinling Guo, Cuiping Ma and Chao
Shi
Journal: Analytical Methods 2023,
15,1915
Institution： Qingdao University
Paper
link：https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2023/AY/D3AY00093A