單鏈DNA Marker（20-75 nt）非預(yù)混型
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貨號
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名稱
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規(guī)格
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RTM507
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單鏈DNA Marker（20-75 nt）
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25次
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● 產(chǎn)品編號及規(guī)格：
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貨號
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名稱
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規(guī)格
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貯存
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RTM507-01
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單鏈DNA Marker（20-75 nt）
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62.5 μl
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-20℃
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DL080-01
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2×TBE尿素上樣緩沖液
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1 ml
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4℃
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DL112-01
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2×非變性PAGE DNA上樣緩沖液
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1 ml
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4℃
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● 產(chǎn)品簡介：
單鏈DNA Marker由不同長度的單鏈DNA分子混合而成，7條帶的大小為20，25，30，35，40，
50，75
nt。該產(chǎn)品不含有上樣緩沖液，可以根據(jù)實驗需求使用不同的上樣緩沖液，用于尿素變性電泳或非變性電泳。電泳后的PAGE膠可以使用單鏈DNA
PAGE電泳染色試劑盒（Cat：RTS5103），核酸PAGE電泳染色試劑盒（Cat：RTS5102），核酸快速高靈敏度染色試劑盒（Cat：RTS5101）或核酸染料如RealSafe
Red（貨號：GR002）或RealSafe
All（貨號：GR004）進行染色，均可以得到清晰的條帶分離效果。
產(chǎn)品附帶2×TBE尿素上樣緩沖液和2×非變性PAGE DNA上樣緩沖液，方便待檢樣品的上樣。
配制好的即用型單鏈DNA Marker以每次上樣5 μl計算，該產(chǎn)品可以使用大約25次。
● 保存條件和運輸：
按照標簽溫度貯存；有效期2年；濕冰運輸。
● 使用方法：
一. 即用型單鏈DNA Marker（20-75
nt）配制方法：
1.1 進行尿素變性電泳：
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即用型單鏈DNA
Marker（20-75 nt）
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配制體積 20 μl
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DNA
Marker（20-75 nt）
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10 μl
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2×TBE尿素上樣緩沖液
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10 μl
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混勻，70℃處理5分鐘
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1.2 進行非變性電泳：
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即用型單鏈DNA
Marker（20-75 nt）
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配制體積 20 μl
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DNA
Marker（20-75 nt）
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10 μl
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2×非變性PAGE DNA上樣緩沖液
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10 μl
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混勻，不用加熱處理
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二. 凝膠制備：
注：以下使用方法均以8×10cm凝膠 厚1.0mm示例，其他規(guī)格凝膠請適當(dāng)調(diào)整。
2.1 TBE-尿素凝膠制備：
2.1.1 可以選擇DNA尿素PAGE電泳試劑盒（Cat：RTE4102））或按照以下程序制膠：
表一 TBE-尿素PAGE分離膠配方表 (總體積5 ml，適用于厚度1.0 mm小板膠)
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單鏈DNA長度
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最佳凝膠濃度
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尿素（克）
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40%PAA
（29:1）
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10×TBE
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補水到總體積
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10%APS
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TEMED
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200-1000 nt
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5%
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2.1克
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0.625 ml
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0.5 ml
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5 ml
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50 μl
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5 μl
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50-400 nt
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8%
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2.1克
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1 ml
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0.5
ml
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5 ml
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50 μl
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5 μl
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30-300 nt
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10%
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2.1克
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1.25 ml
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0.5
ml
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5 ml
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50 μl
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5 μl
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10-150 nt
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15%
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2.1克
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1.875 ml
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0.5
ml
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5 ml
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50 μl
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5 μl
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5-120 nt
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20%
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2.1克
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2.5 ml
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0.5
ml
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5 ml
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50 μl
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5 μl
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2.1.2在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可），然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-5 cm的水層，使凝膠表面保持平整。
2.1.3靜置10-20分鐘，待分離膠和水層之間出現(xiàn)一個清晰的界面后，說明凝膠已聚合。
注：凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長?？梢愿鶕?jù)環(huán)境溫度的不同調(diào)節(jié)APS的加入量。
2.1.4去除覆蓋在分離膠上的水層；按照表二將不同體積成分在一個小燒杯中混合；最后加入10%過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。
表二 TBE-尿素PAGE 4%濃縮配方表 (總體積2 ml，適用于1.0mm厚度膠)
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各組份體積（ml）
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凝膠濃度
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尿素
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40%PAA（29:1）
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10×TBE
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滅菌水
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10%APS
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TEMED
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4%
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0.84克
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0.2 ml
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0.2 ml
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補水至體積2 ml
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20 μl
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2 μl
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2.1.5將濃縮膠溶液加至分離膠的上面，直至凝膠溶液到達前玻璃板的頂端；將梳子插入凝膠內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡。
2.1.6靜置30-60分鐘，等待濃縮膠聚合。
注：凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長?？梢愿鶕?jù)環(huán)境溫度的不同調(diào)節(jié)APS的加入量。
2.2非變性凝膠制備：
2.2.1可以選擇DNA非變性PAGE電泳試劑盒（貨號：RTE4101）或按照以下程序制膠。
2.2.2按照表三將不同體積的成分在小燒杯或試管中混合；最后加入10%APS和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。
2.2.3在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可），然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-5
cm的水層，使凝膠表面保持平整。
2.2.4靜置10-20分鐘，待分離膠和水層之間出現(xiàn)一個清晰的界面后，說明凝膠已聚合
表三 TBE-非變性PAGE分離膠配方表 (總體積5 ml，適用于厚度1.0 mm小板膠)
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各組份體積（ml）
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最佳DNA分離范圍
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凝膠濃度
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滅菌水
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30%PAA（29：1）
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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70-450 bp
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6%
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3
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1.0
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1.0
|
0.05
|
0.005
|
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60-460 bp
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8%
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2.66
|
1.34
|
1.0
|
0.05
|
0.005
|
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50-300 bp
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10%
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2.33
|
1.67
|
1.0
|
0.05
|
0.005
|
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40-200 bp
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12%
|
2
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2.0
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1.0
|
0.05
|
0.005
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25-150 bp
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15%
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1.5
|
2.5
|
1.0
|
0.05
|
0.005
|
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5-100 bp
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20%
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0.66
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3.34
|
1.0
|
0.05
|
0.005
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注：凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長?？梢愿鶕?jù)環(huán)境溫度的不同調(diào)節(jié)APS的加入量。
2.2.5去除覆蓋在分離膠上的水層；按照表四將不同體積成分在一個小燒杯或試管中混合；最后加入10%過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。
表四 TBE-非變性PAGE 4%濃縮配方表 (總體積1.5 ml，適用于1.0mm厚度膠)
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各組份體積（ml）
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凝膠濃度
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滅菌水
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30%PAA（29：1）
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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4%
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1.0
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0.2
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0.3
|
0.02
|
0.002
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2.2.6將濃縮膠溶液加至分離膠的上面，直至凝膠溶液到達前玻璃板的頂端；將梳子插入凝膠內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡。
2.2.7靜置30-60分鐘，等待濃縮膠聚合。
注：凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長?？梢愿鶕?jù)環(huán)境溫度的不同調(diào)節(jié)APS的加入量。
三. 樣品制備：
3.1
根據(jù)實驗?zāi)康?，配制即用型單鏈DNA
Marker樣品（步驟一）。單鏈DNA樣品使用尿素變性電泳，雙鏈DNA樣品使用非變性電泳，單鏈/雙鏈混合樣品使用非變性電泳。
四. 電泳：
4.1. 預(yù)電泳（可選）：電泳槽內(nèi)外加入適量1×TBE緩沖液穩(wěn)壓200V預(yù)電泳30分鐘。電泳結(jié)束后，用1×TBE緩沖液徹底沖洗加樣孔2-3次。
4.2.上樣：根據(jù)梳齒確定Marker上樣量， 一般是10齒1mm厚梳子上樣5
μl，15齒1mm厚梳子上樣3
μl。
4.3. 連接電源線，打開電源開關(guān)，按照以下條件電泳。
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恒電壓
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起始電流
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結(jié)束電流
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電泳時間
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適用條件
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推薦電壓
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200 V
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15-20 mA/板膠
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10-15 mA/板膠
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60+ min
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最佳電壓，最優(yōu)的分辨率
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4.4. 等待上樣緩沖液的溴酚藍指示前沿到凝膠底部時終止電泳，取出凝膠進行后續(xù)實驗。
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膠濃度
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溴酚藍
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二甲苯菁
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5%
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~35 nt
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~130 nt
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8%
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~19 nt
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~75 nt
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10%
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~15 nt
|
~55 nt
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15%
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~10 nt
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~52 nt
|
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20%
|
~8 nt
|
~35 nt
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五．染色：
用單鏈DNA PAGE電泳染色試劑盒（Cat：RTS5103），核酸PAGE電泳染色試劑盒（Cat：RTS5102）或核酸快速高靈敏度染色試劑盒（Cat：RTS5101）染色均可以得到清晰的條帶分離效果。注：如果使用核酸染料染色，RealSafe Red（貨號：GR002）或RealSafe All（貨號：GR004）核酸染料結(jié)合單鏈核酸效果最佳，強烈建議使用以便獲得最佳效果的膠圖。其余染料如GelRed，Goldview，EB等染色效果不好。
● 電泳示例：
1. 使用RealSafe Red核酸染料（貨號：GR002）染色：
15%尿素變性膠分離單鏈DNA
lane 1-9 為10，15，20，25，30，35，40，50，75 nt ssDNA 上樣量為0.5 μg
lane 10：RTM501，單鏈DNA Marker（20-75 nt）預(yù)混型，上樣量5 μl
lane 11：RTM507，單鏈DNA Marker（20-75 nt）非預(yù)混型，配制后上樣量5 μl
lane 12：RTM508，單鏈DNA Marker（10-75 nt）預(yù)混型，上樣量5 μl
電泳條件：1×TBE，恒壓200 V 50 min
染色：RealSafe Red后染20min，紫外激發(fā)