EMSA PAGE凝膠配制試劑盒
PAGE
Electrophoresis Kit for EMSA
|
貨號
|
名稱
|
規(guī)格
|
|
RTE4104
|
EMSA PAGE凝膠配制試劑盒
|
30-60次
|
● 產(chǎn)品組成：
|
貨號
|
名稱
|
規(guī)格
|
貯存
|
|
RTE4104-01
|
40%PAA(37.5:1)
|
50 ml
|
4℃，避光
|
|
RTE4104-02
|
5×TBE
|
50 ml
|
RT
|
|
RTE4104-03
|
80%甘油
|
20 ml
|
RT
|
|
AP020P
|
APS（干粉）
|
5 ml
|
RT（配制后-20℃貯存）
|
|
TA0761-01
|
TEMED
|
0.5 ml
|
4℃，避光
|
● 產(chǎn)品簡介：
EMSA PAGE凝膠配制試劑盒(PAGE Gel Preparation Kit for PAGE)提供了配制EMSA PAGE凝膠所需的各種試劑，用戶只需自備制膠器具和蒸餾水，即可配制不同濃度的EMSA PAGE凝膠。凝膠遷移實驗(也稱凝膠阻滯實驗或電泳遷移率實驗)
(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)，也稱Gel Shift，是一種用于研究蛋白與核酸相互作用的高靈敏實驗技術。主要用于轉錄因子與啟動子相互作用的驗證性實驗，也可應用于蛋白與DNA、蛋白與RNA相互作用研究。EMSA技術基于進行非變性聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳時，蛋白質與DNA或RNA復合物的遷移速度比游離線性DNA或RNA片段慢，從而導致DNA或RNA遷移位置在與蛋白質結合時滯后。
本試劑盒大約可以配制30-50塊常規(guī)大小（8×10 cm）PAGE凝膠，具體數(shù)量根據(jù)凝膠厚度決定：0.75mm厚度凝膠可以配制60塊膠，1 mm厚度凝膠可以配制45塊膠，1.5 mm厚度凝膠可以配制30塊膠。
● 貯存和效期：
本產(chǎn)品常溫運輸；按照標簽溫度貯存；有效期一年。
● 使用說明：
10% APS配制-5 ml：
將0.5 gAPS干粉溶于5 ml滅菌水中，徹底溶解后分裝，1 ml/支，-20℃?zhèn)浯?，每次取一管使用?0% APS應盡量減少常溫存放時間，以防失效，若發(fā)現(xiàn)凝膠聚合時間延長，應考慮更換使用-20度保存的10% APS。
一、制備凝膠步驟：
1.1 參照凝膠模具說明書，裝配好凝膠模具。
1.2按照表格將不同體積的成分在小燒杯中混合；最后加入10%APS和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。配制一塊常用EMSA PAGE膠(8×10 cm)所需凝膠溶液體積：0.75 mm厚度凝膠約5 ml；1 mm厚度凝膠約7 ml；1.5 mm厚度凝膠約10 ml。均含約0.5 ml的余量。
EMSA PAGE凝膠配方表一 (0.75 m厚度凝膠)：
|
|
|
總體積5 ml，適用于厚度0.75 mm小板膠
|
|
|
|
各組份體積（ml）
|
|
膠濃度
|
滅菌水
|
40%PAA(37.5:1)
|
80%甘油
|
5×TBE
|
10%APS
|
TEMED
|
|
4%
|
3.8
|
0.5
|
0.156
|
0.5
|
0.05
|
0.005
|
|
5%
|
3.66
|
0.625
|
0.156
|
0.5
|
0.05
|
0.005
|
|
6%
|
3.54
|
0.75
|
0.156
|
0.5
|
0.05
|
0.005
|
EMSA PAGE凝膠配方表二 (1.0 mm厚度凝膠)：
|
|
|
總體積7 ml，適用于厚度1 mm小板膠
|
|
|
|
各組份體積（ml）
|
|
膠濃度
|
滅菌水
|
40%PAA(37.5:1)
|
80%甘油
|
5×TBE
|
10%APS
|
TEMED
|
|
4%
|
5.3
|
0.7
|
0.22
|
0.7
|
0.07
|
0.007
|
|
5%
|
5.2
|
0.875
|
0.22
|
0.7
|
0.07
|
0.007
|
|
6%
|
5.0
|
1.05
|
0.22
|
0.7
|
0.07
|
0.007
|
EMSA PAGE凝膠配方表三 (1.5 mm厚度凝膠)：
|
|
|
總體積10 ml，適用于厚度1.5 mm小板膠
|
|
|
|
各組份體積（ml）
|
|
膠濃度
|
滅菌水
|
40%PAA(37.5:1)
|
80%甘油
|
5×TBE
|
10%APS
|
TEMED
|
|
4%
|
7.6
|
1
|
0.313
|
1
|
0.1
|
0.01
|
|
5%
|
7.4
|
1.25
|
0.313
|
1
|
0.1
|
0.01
|
|
6%
|
7.1
|
1.5
|
0.313
|
1
|
0.1
|
0.01
|
1.3在玻璃板中灌入凝膠溶液至玻璃板頂端，插入梳子，避免產(chǎn)生氣泡。
1.4靜置20-60分鐘，等待凝膠完全聚合。
|
環(huán)境溫度
|
凝固時間
|
|
低于18度
|
＞60分鐘
|
|
18度
|
~40分鐘
|
|
25度
|
~30分鐘
|
|
高于25度
|
~20分鐘
|
注：凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長。可以根據(jù)環(huán)境溫度的不同調節(jié)APS的加入量。
二、電泳：
2.1預電泳：拔出梳子，用0.5×TBE緩沖液徹底沖洗加樣孔2-3次。電泳槽內外加入適量0.5×TBE緩沖液，穩(wěn)壓100 V預電泳10分鐘。
注：試劑盒配套的5×TBE緩沖液僅夠配制凝膠用，0.5×TBE電泳緩沖液請自己制備，配方如下：
|
終濃度
|
順序
|
原料
|
1升
|
5 升
|
|
44.5 mM
|
1
|
Tris堿 [MW121.14]
|
5.4 克
|
27克
|
|
1 mM
|
2
|
EDTA 2Na·2H2O [MW372.24]
|
0.372 克
|
1.86克
|
|
44.5 MM
|
3
|
硼酸 [MW61.83]
|
2.75 克
|
13.75克
|
|
|
4
|
超純水最后定容至
|
1 升
|
5 升
|
|
|
|
最后pH在8.2-8.3之間，可以不用調節(jié)pH，記錄每批pH
|
2.2 把混合了無色上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內。在多余的某個上樣孔內加入10 μl稀釋好的1X的EMSA 上樣緩沖液(藍色)，用于觀察電泳進行的情況。
2.3 穩(wěn)壓100 V電泳，可以冰浴或4度條件下電泳，確保膠的溫度不超過30℃。電泳至上樣緩沖液中的藍色染料溴酚藍至膠的下緣1/4處，停止電泳。