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免疫沉淀試劑盒（離心柱法）

 ● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

免疫沉淀（Immunoprecipitation）是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于通過(guò)特定抗體捕獲目標(biāo)抗原（蛋白質(zhì)）。該產(chǎn)品使用小于10 μg的抗體即可高效地實(shí)現(xiàn)抗原免疫沉淀。首先將特異性抗體加入樣品中形成免疫復(fù)合物，然后將免疫復(fù)合物加到Protein A/G 瓊脂糖樹(shù)脂中形成Protein A/G-抗體-抗原復(fù)合物，洗滌該復(fù)合物以除去未結(jié)合的物質(zhì)，再以變性洗脫緩沖液或低pH的酸性洗脫緩沖液將結(jié)合的免疫復(fù)合物從Protein A/G上洗脫。

該試劑盒包含確?？乖弋a(chǎn)量的優(yōu)化緩沖液和高效離心柱和收集管，通過(guò)減少處理和混合時(shí)間簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，能有效避免普通離心方法不易吸取上清的問(wèn)題。 離心柱經(jīng)過(guò)優(yōu)化處理，可以使用少至20 μl的Protein A/G樹(shù)脂。

特別提示：試劑盒配套的IP裂解緩沖液含有溫和的去垢劑Triton X-100，可以有效提取胞漿蛋白和核蛋白。然而對(duì)于部分核蛋白（如與染色體緊密結(jié)合的核蛋白）以及膜蛋白（特別是多次跨膜蛋白）提取效果不好，不建議使用該試劑盒進(jìn)行免疫沉淀。

以每次使用20 μl Protein A/G 瓊脂糖樹(shù)脂計(jì)算，試劑盒可以進(jìn)行20次IP反應(yīng)。

● 產(chǎn)品組成：

● 產(chǎn)品貯存、運(yùn)輸及效期：

按照標(biāo)簽溫度貯存；常溫運(yùn)輸；有效期一年。

● 用前必讀：

1. 除非另有說(shuō)明，所有操作在 4℃下進(jìn)行。

2. 樹(shù)脂的所有離心步驟需在低速（如 1000×g）、1 min條件下操作。離心速度大于 5000× g 可能會(huì)導(dǎo)致樹(shù)脂聚集，難以重懸。

3. 離心柱離心過(guò)程中，使用2 ml離心管收集時(shí)流穿的液體體積應(yīng)不超過(guò) 600 μl，使用1.5 ml離心管

收集時(shí)則應(yīng)不超過(guò) 300 μl。體積超出可能導(dǎo)致柱內(nèi)產(chǎn)生回壓及洗滌和洗脫不完全。

4. 使用此試劑盒時(shí)抗體將與免疫沉淀的抗原一起被洗脫。因此，在還原型 SDS-PAGE 凝膠或 Western blot時(shí)至少產(chǎn)生三個(gè)蛋白條帶：抗體重鏈（ ~50 kD） 、輕鏈（~25 kD ）和抗原。如果抗體條帶掩蓋了免疫沉淀的抗原，則可用重鏈或輕鏈專(zhuān)一性IgG-HRP檢測(cè)目的蛋白，避免輕重鏈的干擾。

5. 為了優(yōu)化結(jié)果，盡量使用親和純化后的抗體。盡管也可使用血清，但血清樣品中針對(duì)目的抗原的特異性抗體含量可能僅占IgG 總量的 1-2%，因此，將導(dǎo)致抗原產(chǎn)量低。

6.  IP 裂解緩沖液已進(jìn)行過(guò)代表性細(xì)胞類(lèi)型的檢測(cè)，包括但不限于下列細(xì)胞系：  HeLa， Jjurkat，K562，A431，A549，MOPC，NIH  3T3 和 U2OS。通常情況下，10⁶的 HeLa 細(xì)胞可以產(chǎn)生約10 mg的細(xì)胞團(tuán)塊，按照~3 μg/μl的配比使用 IP裂解緩沖液（即 100 μl IP裂解緩沖液可以裂解~300 μg細(xì)胞團(tuán)塊 ）。  

7. 為了獲得最佳結(jié)果，可添加蛋白酶抑制劑或/和磷酸酶抑制劑，以盡量減少細(xì)胞裂解液中蛋白質(zhì)的降解和去磷酸化。

8. IP裂解緩沖液可兼容BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：RTP7102）。

9. 在免疫沉淀時(shí)，建議按照步驟2.2使用與捕獲抗體種屬相同的正常IgG配制相同稀釋比的工作液作為陰性對(duì)照。本試劑盒中未提供IgG，客戶(hù)請(qǐng)自備。

● 操作步驟：

一. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞裂解 ：

1.1 裂解貼壁細(xì)胞 ：

1.1.1 小心去除細(xì)胞中的培養(yǎng)基。

1.1.2 用 PBS清洗細(xì)胞一次。

1.1.3 將冰上預(yù)冷的 IP裂解緩沖液加入細(xì)胞中（表1）；冰上孵育 5 分鐘并間歇混勻；用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞或用移液器吹打下細(xì)胞。

表 1 不同標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)皿/板中 IP裂解緩沖液的建議添加量

1.1.4 將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到微量離心管中，冰浴10-30分鐘，間歇混勻；13000 ×g離心10分鐘以沉淀細(xì)胞碎片。

1.1.5 將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的微量離心管中用于進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定和后續(xù)分析。

1.2 裂解懸浮細(xì)胞：

1.2.1將細(xì)胞懸浮液在 450 ×g下離心 5分鐘以沉淀細(xì)胞；棄掉上清。

1.2.2將細(xì)胞團(tuán)塊用 PBS重懸洗滌一次。450× g離心 5分鐘再次沉淀細(xì)胞。

1.2.3將冰上預(yù)冷的 IP裂解緩沖液加到細(xì)胞團(tuán)塊中。每 50 μl濕重細(xì)胞沉淀體積加入 500 μl IP裂解緩沖液。注：(五百萬(wàn)，5×10⁶) Jurkat細(xì)胞，其細(xì)胞沉淀體積（PCV，Packed Cell Volume）大約為50 μl。

1.2.4  將細(xì)胞裂解液在冰上孵育10-30分鐘并間歇混勻。13000 ×g離心10 分鐘去除細(xì)胞碎片。

1.2.5 將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的微量離心管中用于進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定和后續(xù)分析。

二. 制備免疫復(fù)合物：

 注：樣品用量和孵育時(shí)間取決于每個(gè)特定的抗體-抗原體系，并且可能需要優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案以使產(chǎn)量最大化。以下方案是針對(duì) 2-10 μg 親和純化的抗體（Protein A/G 瓊脂糖樹(shù)脂使用20 μl），且可以根據(jù)需要按比例放大。

2.1 將 2-10 μg親和純化的抗體與步驟1.2.5得到的細(xì)胞裂解液上清在微量離心管中混合，混合體積控制在300 - 600 μl。每個(gè)IP反應(yīng)總蛋白建議量是 500-1000 μg。

2.2 可選：可以使用與IP捕獲抗體種屬相同的正常IgG配制相同稀釋比的工作液，作為陰性對(duì)照。如IP捕獲抗體使用兔源抗體，陰性對(duì)照則使用兔IgG。

2.3 在 4℃旋轉(zhuǎn)孵育 1小時(shí)至過(guò)夜，以形成免疫復(fù)合物。

三. 捕獲免疫復(fù)合物：

3.1 輕旋 Protein A/G 瓊脂糖樹(shù)脂，以獲得均一的懸浮液。使用大口徑或截短槍頭取20 μl樹(shù)脂漿液加入離心柱中。將離心柱放于收集管中，1000×g 離心1分鐘，棄掉流穿液體。

3.2 用200 μl預(yù)冷的洗滌緩沖液洗滌樹(shù)脂兩次；每次洗滌后棄掉流穿液體。

3.3 將步驟2.3的免疫復(fù)合物樣品加入含有Protein A/G 瓊脂糖樹(shù)脂的離心柱中，蓋上管蓋溫和地上下翻轉(zhuǎn)常溫孵育 1 小時(shí)。

3.4 將離心柱置于一干凈的2 ml離心管中（自備）。1000×g 離心1分鐘并保留流穿液體。

注：在確定 IP反應(yīng)成功之前不要丟棄該液體。

3.5 將離心柱置于一個(gè)新的1.5 ml離心管中(自備)，加入200 μl 洗滌緩沖液，1000×g 離心 1 分鐘，棄流穿液。

3.6 重復(fù)步驟3.5二次。

四. 洗脫免疫復(fù)合物：

注：有兩種方案可以洗脫免疫復(fù)合物。變性緩沖液洗脫適用于 Western blot 分析；酸性洗脫液適用于酶法或功能測(cè)定。

4.1 變性洗脫液洗脫：

4.1.1 將含有樹(shù)脂的離心柱置于一個(gè)新的1.5 ml離心管中（自備），加入50 μl 變性洗脫液，在95℃下孵育10 分鐘。

4.1.2 1000×g 離心1 min，收集洗脫液。

注：加熱含有變性洗脫液的樹(shù)脂后，該樹(shù)脂將不能被重復(fù)使用且必須丟棄。

4.2 酸性洗脫液洗脫：

4.2.1 將離心柱置于一個(gè)新的1.5 ml離心管中（自備），加入 50 μl酸性洗脫液。在常溫下孵育 10分鐘。1000×g 離心1min，收集洗脫液。

4.2.2 為了中和低pH 值的酸性洗脫緩沖液（例如為了進(jìn)行下游的酶法或功能測(cè)定），洗脫后立即向洗脫液中加入1/10體積中和緩沖液，如50 μl洗脫液加入5 μl中和緩沖液，混勻。

● 實(shí)驗(yàn)示例：

1 制備免疫復(fù)合物：

GAPDH-IP：5 μl GAPDH兔單抗加400μl（640 μg）K562總蛋白（1.6 μg/μl），4度 混勻1h

IgG-IP：1 μl兔IgG加400 μl（640 μg）K562總蛋白（1.6 μg/μl），4度 混勻1h

2 捕獲免疫復(fù)合物：

取20 μl Protein A/G加入離心柱中，1000g min；100 μl IP裂解液洗滌兩次；

將免疫復(fù)合物上柱，RT 混勻1h，形成Protein A/G-Ab-An復(fù)合物；200 μl 1×TBS洗滌柱3次

3 洗脫免疫復(fù)合物-變性洗脫：

用干凈的1.5ml 離心管做收集管，柱子中加入50 μl 變性洗脫液，95度 10 min；1000g 1min，收集管內(nèi)為待測(cè)樣品；IgG-IP 上樣10 μl，GAPDH-IP 上樣5，10，15 μl。

Input為IP裂解液提取K562總蛋白，5×BME配制成1μg/μl上樣液，上樣10 μl（10 μg）

4 電泳：4-20% 梯度膠 200V 50min

5 轉(zhuǎn)膜：Turbo快速半干轉(zhuǎn)，濾布，0.22 NC膜，恒流1.3A 10min。

6 快封：快速封閉液（WR5020 ）RT封閉10min

7 檢測(cè)：兔GAPDH單抗1：5000 RT 1h，羊抗兔IgG-HRP 1：5000 RT 1h，ECL 1秒