RIPA裂解液(強(qiáng))
● 產(chǎn)品包裝：
|
產(chǎn)品編號(hào)
|
產(chǎn)品名稱
|
產(chǎn)品包裝
|
說(shuō)明書(shū)
|
|
RL1020
|
RIPA裂解液(強(qiáng))
|
100 ml
|
1份
|
● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
RIPA裂解液(RIPA
Lysis Buffer)是一種傳統(tǒng)的細(xì)胞組織快速裂解液。RIPA裂解液裂解得到的蛋白樣品可以用于常規(guī)的Western、IP等。RIPA的本意是Radio Immunoprecipitation Assay。RIPA裂解液的配方有很多種，根據(jù)其裂解液的強(qiáng)度大致可以分為強(qiáng)、中、弱三類。RIPA裂解液(強(qiáng))的主要成分為50 mM Tris (pH 7.4)，150 mM NaCl，1% Triton
X-100，1%
sodium deoxycholate，0.1% SDS，以及sodium orthovanadate，sodium
fluoride，EDTA，EGTA等多種抑制劑?？梢杂行б种频鞍捉到?。由于含有較高濃度的Triton X-100等干擾物質(zhì)，不能用傳統(tǒng)Bradford法測(cè)定由本裂解液裂解得到樣品的蛋白濃度，可以使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：RTP7102）或Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒（去垢劑兼容型）（貨號(hào)：RTP7104）測(cè)定蛋白濃度。
● 保存條件：
-20℃保存，一年有效。
● 注意事項(xiàng)：
1.為取得最佳的使用效果，盡量避免過(guò)多的反復(fù)凍融?？梢赃m當(dāng)分裝后使用。需自備PMSF。裂解樣品的所有步驟都需在冰上或4℃進(jìn)行。
2. RIPA裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一小團(tuán)透明膠狀物，屬正?，F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復(fù)合物。在不檢測(cè)與基因組DNA結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；如果需要檢測(cè)和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過(guò)超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如果檢測(cè)一些常見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄因子，例如NF-kappaB、p53等時(shí)，通常不必進(jìn)行超聲處理，就可以檢測(cè)到這些轉(zhuǎn)錄因子。
● 使用說(shuō)明：
1. 準(zhǔn)備RIPA裂解液：
融解RIPA裂解液，混勻；取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入1/100體積的100 mM PMSF，使PMSF的最終濃度為1 mM。
2. 細(xì)胞蛋白提?。?/b>
2.1 貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，加入適量1×PBS，輕柔漂洗一遍，不要擾動(dòng)貼壁細(xì)胞。按照6孔板每孔加入100-200 μl裂解液的比例加入裂解液，移液器吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸，冰上裂解細(xì)胞5分鐘，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞收集于1.5 ml離心管中，冰上繼續(xù)裂解15分鐘，間歇混勻。
|
培養(yǎng)板規(guī)格/培養(yǎng)皿表面積
|
細(xì)胞量
|
RIPA推薦使用量
|
|
100 mm培養(yǎng)皿
|
1.5×107
|
0.5-1 ml
|
|
60 mm培養(yǎng)皿
|
5×106
|
0.25-0.5 ml
|
|
35 mm培養(yǎng)皿
|
2×106
|
0.2-0.4 ml
|
|
6孔板
|
2.5×106
|
100-200 μl
|
|
24孔板
|
5×105
|
100-150 μl
|
|
96孔板
|
1×105
|
50-100 μl
|
2.2 懸浮細(xì)胞：450 g
4℃ 離心5 min收集細(xì)胞；用適量1×PBS重懸細(xì)胞，450 g 4℃ 離心5 min收集細(xì)胞；重復(fù)漂洗細(xì)胞一次；按照細(xì)胞沉淀體積（PCM）20 μl加入200 μl RIPA的比例加入RIPA，混勻細(xì)胞沉淀，冰浴處理15分鐘，間歇混勻。
注：2×106 Jurkat細(xì)胞，其細(xì)胞沉淀體積（PCM，Packed Cell Volume）大約為20 μl。
2.3 裂解細(xì)胞：
裂解混合物超聲波處理（超聲條件根據(jù)儀器調(diào)整，建議條件為）；如沒(méi)有超聲破碎儀，可以使用注射器用27G針頭處理裂解物10-15次（貨號(hào)：PE2719 ，蛋白提取針頭套裝），以徹底裂解細(xì)胞。冰浴處理15分鐘。
注：裂解中細(xì)胞會(huì)釋放出變性的核酸，呈團(tuán)狀粘稠透明樣，如不進(jìn)行超聲或針頭裂解處理，會(huì)導(dǎo)致裂解物非常粘稠，大大降低蛋白提取的得率和純度。
2.4 離心收集上清：
充分裂解后，4℃ 16000
g離心10分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
3. 組織樣品蛋白提取：
3.1 手術(shù)切除的組織塊迅速置于預(yù)冷的生理鹽水中，漂洗數(shù)次，洗凈組織血跡，用濾紙吸
干組織表面液體，將組織切成細(xì)小的碎片。
3.2 按照每20 mg組織加入200 μl裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。)
3.3 用玻璃勻漿器冰浴勻漿5-10次，收集勻漿后的裂解混合物，超聲波處理（超聲條件根據(jù)儀器調(diào)整，建議條件為）；如沒(méi)有超聲破碎儀，可以使用注射器用27G針頭處理裂解物10-15次（貨號(hào)：PE2719 ，蛋白提取針頭套裝），以徹底裂解細(xì)胞。裂解物冰浴處理15分鐘。
注：裂解中細(xì)胞會(huì)釋放出變性的核酸，呈團(tuán)狀粘稠透明樣，如不進(jìn)行超聲或針頭裂解處理，會(huì)導(dǎo)致裂解物非常粘稠，大大降低蛋白提取的得率和純度。
3.4 充分裂解后，4℃ 16000
g離心10分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
實(shí)驗(yàn)示例：
Jurkat RIPA總蛋白提取，GAPDH檢測(cè)
總蛋白提?。?×106 Jurkat細(xì)胞，450 g 離心收集，去上清，PBS漂洗兩次，沉淀中加入200 μl RIPA（加2 μl 100 mM PMSF），冰上裂解5分鐘，4℃ 16000 g 15 分鐘，上清即為總蛋白（TP）。
電泳：RTD6132-15%3.3C 200 V 33-12 mA 55 min
轉(zhuǎn)膜：NC膜，1×RealBlot快速轉(zhuǎn)膜液濕轉(zhuǎn)，穩(wěn)流400 mA，電壓變化64-57 V，轉(zhuǎn)膜時(shí)間35 min
封閉：無(wú)蛋白快速封閉液，RT 20 min
一抗孵育：GAPDH 羊抗兔多抗，一抗稀釋液稀釋1：2000
二抗孵育：羊抗兔IgG-HRP，二抗稀釋液稀釋1：5000
檢測(cè)：ECL發(fā)光檢測(cè)
實(shí)驗(yàn)示例：
1、作用：①利用去污劑破壞脂質(zhì)雙分子層，破裂細(xì)胞；②溶解蛋白；③蛋白變性使其穩(wěn)定；④抑制蛋白酶/核酸酶活性（根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的目的不同，裂解液中會(huì)加入蛋白酶抑制劑或DNA/RNA酶抑制劑，方便目的物的提取。）2、細(xì)胞裂解液有效成分一般使用的是去污劑。去污劑是由一個(gè)疏水尾端基團(tuán)和一個(gè)極性親水頭端基團(tuán)組成的有機(jī)化合物。在一定的溫度條件下，以特定濃度溶解于水時(shí)，去污劑分子會(huì)形成膠束，疏水基團(tuán)部分位于膠束內(nèi)部，而極性親水基團(tuán)則在其外部。去污劑膠束的疏水核心區(qū)域與蛋白質(zhì)的疏水表面結(jié)合，形成可溶性的蛋白質(zhì)-去垢劑復(fù)合物。去污劑根據(jù)其親水基團(tuán)的不同分為：陰/陽(yáng)離子去污劑、非離子型兩性去污劑、兩性去污劑。1）陰/陽(yáng)離子型去污劑：離子去污劑是由一個(gè)疏水鏈和一個(gè)陽(yáng)離子或陰離子的極性頭端基團(tuán)組成。此類去污劑活性較強(qiáng)，作用強(qiáng)烈，會(huì)更大程度的改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，更容易受到pH、離子強(qiáng)度和反離子的性質(zhì)等因素影響。如陰離子去污劑-十二烷基硫酸鈉（SDS）、陰離子去污劑-脫氧膽酸鈉（Sodium deoxycholate）等。
離子型去污劑：非離子型去污劑和離子型不同，它們的頭端基團(tuán)是沒(méi)有極性的親水基團(tuán)，是比較溫和的表面活性劑。它們可以破壞蛋白質(zhì)-脂質(zhì)以及脂質(zhì)-脂質(zhì)之間的連接，但是不能破壞蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的連接，而且大多非離子去污劑不能使蛋白質(zhì)變性。因此，這種去污劑可以使蛋白質(zhì)溶解和分離，但卻保留了蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象、功能以及它們的相互作用。如Triton X-100、乙基苯基聚乙二醇（NP-40）、Tween-80等。
3）兩性去污劑：兩性離子去污劑頭端基團(tuán)是親水性，含有正負(fù)電荷各一個(gè)，因此呈現(xiàn)電中性。兩性去污劑在酸性溶液中是正離子，在堿性溶液是負(fù)離子， 可在任何酸堿度的溶液中使用。相對(duì)于離子型去污劑其更少產(chǎn)生變性，相對(duì)于非離子型去污劑，又可以更有效的破壞蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)鍵并減少聚集。如CHAPS。Tris，三羥甲基氨基甲烷，是一種有機(jī)化合物，溶于乙醇和水，是核酸和蛋白質(zhì)的溶劑，廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中緩沖液的制備。
Tris為弱堿，在25°C下，它的pKa為8.1；根據(jù)緩沖理論，Tris緩沖液的有效緩沖范圍在pH7.0到9.2之間。0.1mol/l的水溶液pH為10.4，一般加入鹽酸以調(diào)節(jié)pH值，即可獲得所需pH值的緩沖液。
主要應(yīng)用有：①1M Tris-HCl pH6.8、1.5M Tris-HCl pH8.8和5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液是SDS-PAGE最常用的試劑。②在Tris鹽酸緩沖液中加入EDTA制成“TE緩沖液”，TE緩沖液被用于DNA的穩(wěn)定和儲(chǔ)存。將調(diào)節(jié)pH值的鹽酸換為乙酸即可以得到“TAE（Tris/Acetate/EDTA）緩沖液”，換成硼酸則獲得“TBE（Tris/Borate/EDTA）緩沖液”。TAE和TBE緩沖液常用于核酸電泳實(shí)驗(yàn)中。
不同裂解成分的裂解強(qiáng)度不同，可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求選用不同的裂解液。
1、NP40 lysis buffer：主要成分為50mM Tris(pH7.4)，150mM NaCl，1% NP-40。NP-40是一種很溫和的非離子型去污劑，1%濃度基本可以破壞掉細(xì)胞膜，而對(duì)核膜的破壞作用較弱，結(jié)合特定的緩沖液可以獲得胞漿蛋白，適用于膜蛋白非變性條件下的溶解。與蛋白結(jié)合力強(qiáng)，用于防止物質(zhì)分子疏水間相互作用，確保蛋白的充分溶解和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。常用于常規(guī)的Western、IP和co-IP和ELISA，如需要裂解細(xì)胞核膜獲取核蛋白，可用1%NP40+0.1%SDS（WB實(shí)驗(yàn)）或用1%NP40+超聲（IP實(shí)驗(yàn)）。2、SDS lysis buffer：主要成分為50mM Tris (pH8.1)，1% SDS；是一種比較強(qiáng)烈的細(xì)胞組織裂解液，可裂解核膜；用于常規(guī)Western、ChIP等。3、RIPA裂解液：組分為25 mM Tris-HCl, pH 7.6、150 mM NaCl、1% NP-40、1%脫氧膽酸鈉、0.1%十二烷基硫酸鈉（SDS）。RIPA裂解液是一種傳統(tǒng)的細(xì)胞組織快速裂解液，獲得的蛋白樣品可用于常規(guī)WB、IP等實(shí)驗(yàn)。
4、IP裂解液：組分為25 mM Tris-HCl, pH 7.4、150 mM NaCl、1% NP-40、1% mM EDTA、5% 甘油。IP裂解液是一種改良后的RIPA裂解液，具中等強(qiáng)度效力，可高效溶解細(xì)胞蛋白，但不會(huì)像RIPA一樣釋放染色體組DNA或破壞蛋白復(fù)合物。適合下游免疫沉淀或親和吸附應(yīng)用。
5、Tris-Triton裂解液：組分為10mM Tris，pH7.4、100mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA（鈣離子螯合劑）、1% Triton X-100、10% 甘油、0.1% SDS、0.5% 脫氧膽酸鈉。Tris-Triton裂解液是非離子型表面活性劑，效力介于NP-40和SDS之間，下游應(yīng)用有WB、ELISA、IP。
6、紅細(xì)胞裂解液：
紅細(xì)胞裂解液是一種比較溫和的紅細(xì)胞去除方法，它既不損傷有核細(xì)胞又能充分的去除紅細(xì)胞；主要用于經(jīng)酶消化分散的組織細(xì)胞的分離純化，淋巴細(xì)胞的分離純化以及組織細(xì)胞蛋白與核酸提取等實(shí)驗(yàn)中紅細(xì)胞的去除。經(jīng)紅細(xì)胞裂解液裂解得到的組織細(xì)胞中不含紅細(xì)胞，可進(jìn)一步用于原代培養(yǎng)、細(xì)胞融合、流式細(xì)胞分析、核酸與蛋白的分離和提取等。
氯化銨是紅細(xì)胞裂解液的主要效應(yīng)物質(zhì)，氨根離子不能通過(guò)細(xì)胞膜，而其他離子可以通過(guò)，造成細(xì)胞內(nèi)外的離子濃度差異，形成了滲透壓差，外部的水分會(huì)擴(kuò)散至細(xì)胞內(nèi)，使紅細(xì)胞膨脹，達(dá)到裂解的效果。由于紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，因此膨脹的耐受能力較差，絕大部分就會(huì)被漲破。碳酸鹽的主要作用為PH緩沖。EDTA與鎂離子和鈣離子形成的螯合物主要起到破壞細(xì)胞膜穩(wěn)態(tài)的作用，此作用對(duì)白細(xì)胞影響很小，所以這種裂解液可以在裂解紅細(xì)胞的同時(shí)較小的影響白細(xì)胞。
使用RIPA（貨號(hào)：RL1020）發(fā)表部分文章列表
1. [2022 IF=2.1] METTL3-mediated
methylation of CYP2C19 mRNA may aggravate clopidogrel resistance in ischemic stroke
patients.
Author: Quandan Tan, Le
Yang, Shanshan Yuan, Danni Zheng, Yapeng Lin, Kejie Chen, Ying He, Shuntian
Chen, Junli Hao, Jin Dai, Song He, Fengkai Mao, Xinyi Leng, Haisong Jiang, Jie
Yang.
Journal: Open
Medicine 2024; 19: 20240899.
Institution： University of Electronic Science and Technology of
China
Paper link：https://doi.org/10.1515/med-2024-0899
2. [2023 IF=2.8] Anti?tumor activity of butorphanol
in colorectal cancer via targeting SIGMAR1.
Author: Xueqi Hou, Longfei Qu,Yong Xu,Jie Liu,
Jianlian Guo
Journal: Discover Oncology (2024) 15:711
Institution：School of Medicine,
Xiamen University
Paper link： https://doi.org/10.1007/s12672-024-01581-1